RiboPrinter® 在肉毒梭菌鑒定和分子分型中的應用

梭狀芽孢桿菌是一個(gè)多樣化的革蘭氏陽(yáng)性菌屬，專(zhuān)性厭氧，在環(huán)境中普遍存在。這個(gè)屬大約包含了100多個(gè)種，基因組內總體的G+C含量范圍在22-55%，反映出該屬內的細菌在系統進(jìn)化關(guān)系上的巨大差異。

該屬內最主要的食源性致病菌為肉毒梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，它們均可通過(guò)毒素介導，通過(guò)直接產(chǎn)生毒素（如食源性肉毒中毒），或在腸道內生成毒素（如嬰兒肉毒中毒和產(chǎn)氣莢膜梭菌腹瀉），從而引發(fā)食源性細菌性疾病。

肉毒梭菌簡(jiǎn)介

肉毒梭菌（Clostridium botulinum）屬于厭氧性梭狀芽孢桿菌，為革蘭氏陽(yáng)性的多形態(tài)大桿菌，芽孢位于菌體近端，使菌體?#39135;仔位?#32178;(wǎng)球拍狀。根據抗原性的不同，肉毒梭菌可分為8個(gè)型，分別是A、B、Cα、Cβ、D、E、F和G型。

肉毒梭菌產(chǎn)生的外毒素稱(chēng)為肉毒神經(jīng)毒素（BoNTs，botulinum neurotoxins），肉毒毒素在目前已知毒素中毒性最強，一個(gè)人的致死劑量大約為1 µg，比氰化鉀毒力大10000倍，和炭疽一樣，可作為生物武器。BoNTs可引發(fā)食物中毒，即肉毒中毒，能夠引起人類(lèi)中毒的主要型別為A、B和E型。肉毒中毒的臨床表現不同于其他食物中毒，胃腸道癥狀很少見(jiàn)，主要為神經(jīng)末梢麻痹，發(fā)病率不高，但死亡?#31034;?#32048;菌性食物中毒之首。

肉毒梭菌是一種腐物寄生菌，在自然界分布廣泛，食物中肉毒梭菌主要來(lái)源于環(huán)境，如塵埃、糞便等，尤其是帶菌土壤。肉毒梭菌的抵抗力一般，在45℃以上都受到抑制，80℃經(jīng)20min可被殺滅。但其芽孢的抵抗力極強，可耐煮沸長(cháng)達1-6h之久，于180℃干熱5-15min或于120℃高壓蒸汽下10-20min才能滅活，在酒精中可存活2個(gè)月，10%的HCl需60min才能破壞芽孢。蛋白分解型的肉毒梭菌（A、B和F型）芽孢比非蛋白分解型的B、E和F型的芽孢對熱具有更強的抵抗力。芽孢在厭氧環(huán)境的食?#20998;?#21487;發(fā)芽繁殖產(chǎn)生肉毒毒素，人類(lèi)因食入已產(chǎn)生毒素的食品而發(fā)生肉毒中毒。另外，因肉毒梭菌隨蜂蜜等食物進(jìn)入嬰兒腸道內產(chǎn)毒引發(fā)的嬰兒肉毒中毒也有存在。

肉毒梭菌的形態(tài)特征和分類(lèi)學(xué)

肉毒梭菌為多形態(tài)的厭氧性的桿狀菌，長(cháng)約4-6?m，寬約0.6-1.2 ?m，兩側平行，兩端鈍圓，直桿狀或稍彎曲，可形成芽孢，卵圓形，位于次級端或偶有位于中央，常見(jiàn)很多游離芽孢，多單在，?#23478;?jiàn)成雙或短鏈，A型和B型菌的芽孢大于菌體，位于菌體近端，使菌體?#39135;仔位?#32178;(wǎng)球拍狀，其他的型芽孢一般不超過(guò)菌體寬度。有時(shí)呈現長(cháng)絲狀或鏈狀，有時(shí)能見(jiàn)到舟形、帶把柄的檸檬形、蛇樣線(xiàn)狀和染色較深的球莖狀，這些屬于退化型，當菌體開(kāi)始形成芽孢時(shí)，常常伴隨著(zhù)自溶現象。肉毒梭菌具有4-8根周生性鞭毛，運動(dòng)遲緩，沒(méi)?#26143;v膜。

根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》，肉毒梭菌歸屬為原核生物界、厚壁菌門(mén)、厚壁菌綱、芽孢桿菌科的梭菌屬（Clostridium）。

肉毒梭菌這個(gè)種是基于?#25105;?#30340;表型特征，即產(chǎn)生BoNTs的這個(gè)特性來(lái)分類(lèi)定義的。Collins等（1998）又將其分為4個(gè)組（Group I-IV），這些群呈現出非常多樣化的基因型和表型特征（見(jiàn)表一），菌株之間的差異程度要遠遠超過(guò)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株之間的差異程度。

這種情況有時(shí)更為復雜，導致分類(lèi)學(xué)上的困難，?#39511;橛行?#33740;株從發(fā)育關(guān)系上來(lái)說(shuō)與肉毒梭菌非常相近，但是并不產(chǎn)生神經(jīng)毒素，因而沒(méi)有歸入肉毒梭菌這個(gè)種，如生孢梭菌（Clostridium sporogenes），諾維氏梭菌（Clostridium novyi），和其他一些未命名的梭菌；而?#34892;?#33740;株能生產(chǎn)神經(jīng)毒素，卻因系統發(fā)育較遠，并未歸入肉毒梭菌，如巴氏梭菌（Clostridium baratii）以及酪酸梭菌（Clostridium butyricum）。更復雜的情況是，Collins等（1998）還發(fā)現BoNTs的毒力基因能在菌株間不穩定地平行轉移，從而產(chǎn)生不產(chǎn)毒的變種，或是攜帶部分或未知的BoNTs基因。正?#39511;?#32905;毒梭菌的種內多樣性，導致了對于該細菌的分類(lèi)學(xué)研究?#28304;?#22312;爭議，給各種肉毒梭菌的檢測、分離和鑒定方法，甚至是16S測序法鑒定都帶來(lái)了一定的難度。

表一：肉毒梭菌的基本特征

特征	組I	組II	組III	組IV
毒素類(lèi)型	A, B, F	B, E, F	C, D	G
人類(lèi)疾病病原	是	是	是	否
最低生長(cháng)溫度（℃）	10	3.3	15	不確定
最適生長(cháng)溫度（℃）	35-40	18-25	40	37
最低生長(cháng)pH值	4.6	5.0	5.0	不確定
最低生長(cháng)水活度Aw	0.94	0.97	不確定	不確定
氯化鈉抑制	10%	5%	2%	不確定
芽孢D100℃值（分鐘）	25	< 0.1	0.1-0.9	0.8-1.12
芽孢D121℃值（分鐘）	0.1-0.2	< 0.001	不確定	不確定
蛋白分解活性	是	否	否	微弱
脂肪分解活性	是	是	是	否
糖分解活性	否	是	微弱	否
相近的非產(chǎn)毒梭菌屬菌種	C. sporogenes C. putrificum	C. beijerinkii	C. novyi C. haemolyticum	C. subterminale C. histolyticum C. linosium
毒力基因位置	染色體	染色體	噬菌體	質(zhì)粒
基因組G+C含量（mol%）	26-29	27-29	26-28	28-30

肉毒梭菌的傳統鑒定和分離方法

正如前述，肉毒梭菌這個(gè)種是基于?#25105;?#30340;表型特征，即產(chǎn)生BoNTs的這個(gè)特性來(lái)分類(lèi)定義的，所以傳統的表型和基因型鑒定方法，如生化反應、細胞脂肪酸組分分析以及16S測序等并不能給出明確的鑒定結果，見(jiàn)Collins（1998），Brett（1998），Ghanem（1991）。比如，16S測序方法已被證實(shí)無(wú)法區分肉毒梭菌及其兩個(gè)近親：諾維氏梭菌（Clostridium novyi）和生孢梭菌（Clostridium sporogenes）。

肉毒梭菌培養分離的第一步是增菌培養基及培養條件的確定。培養基可優(yōu)先選用預還原性（Pre-reduced）厭氧無(wú)菌的熟肉基質(zhì)培養基（可含或不含葡萄糖成分）（cooked meat medium），碎肉葡萄糖淀粉培養基（chopped-meat glucose-starch medium），或胰蛋白胨葡萄糖酵母提取肉湯（tryptone-peptone glucose yeast extract broth）。胰蛋白酶可被添加到配方中以滅活細菌素和激發(fā)神經(jīng)毒素。溶菌酶的加入有助于復活熱損傷的孢子，尤其適合于非蛋白分解型肉毒梭菌的菌株。

由于不同組別的肉毒梭菌的最適生長(cháng)條件并不統一（見(jiàn)表一），所以最優(yōu)的培養溫度的選擇仍然是個(gè)問(wèn)題。Solomon（2001）等推薦采用28℃用于II組肉毒梭菌的培養，而用35℃用于其他組別的培養，不過(guò)目前已經(jīng)有質(zhì)疑認為其不適用魚(yú)類(lèi)和貝殼類(lèi)食?#20998;?#32905;毒梭菌的檢測。Anon（1998）等推薦采用30℃用于所有組別的菌株的培養，但在這個(gè)條件下I組的菌株得不到最優(yōu)的生長(cháng)。

培養5天后，接種的肉湯需做小鼠生物實(shí)驗（Mouse Bioassay）以檢測BoNTs的產(chǎn)生情況。另需培養10天以檢測受損芽孢或延遲產(chǎn)芽菌株的生長(cháng)情況仍然是十分必要的。所有的培養物還需最終通過(guò)鏡檢檢測，觀(guān)察菌株的形態(tài)特征，以獲得鑒定結論。

疑似陽(yáng)性的肉湯樣本，連同疑似原因食品和臨床樣本（尤其是糞便）還需選用上述培養基進(jìn)行嚴格厭氧環(huán)境下的二次培養以進(jìn)行確認。培養基需包含以下成分：

卵黃：以檢測酯酶陽(yáng)性的肉毒梭菌菌株，見(jiàn)Silas（1985）

選擇性抗菌劑：環(huán)絲氨酸，?#21069;?#30002;基異惡唑，甲氧芐啶等，見(jiàn)Silas（1985），Dezfulian（1981），Mills（1985）

由于肉毒梭菌不同組別菌株存在較大差異（尤其是I組和II組），專(zhuān)家們一致建議采用含抑菌劑和不含有抑菌劑的選擇性平板同時(shí)進(jìn)行對照實(shí)驗，以便分析和獲得更為準確的結果。

典型的肉毒梭菌的菌落形態(tài)見(jiàn)圖一：

Typical colonial growth of C. botulinum, together with an atypical lipase negative culture: Classically, C. botulinum colonies are usually gray-white on blood containing agars with circular irregular edges, and a clear zone of β-hemolysis.

Clostridium botulinum growing on blood agar （Below Left）

Clostridium botulinum growing on egg yolk agar showing the lipase reaction after 72 hours of incubation （Below Right）

主要的肉毒梭菌的生化特征見(jiàn)表二和表三：

表二：各型肉毒梭菌的生化特性

型別	A	B	C	D	E	F
葡萄糖發(fā)酵	+	+	+	+	+	+
麥芽糖發(fā)酵	+	(±)	(±)	(±)	(±)	(±)
乳糖發(fā)酵	-	-	(-)	(-)	-	-
蔗糖發(fā)酵	(-)	(±)	-	-	-	(+)
靛基質(zhì)產(chǎn)生	(±)	-	(-)	(-)	-	-
明膠液化	-	(+)	(±)	(±)	(±)	(+)
牛奶消化	(+)	(±)	-	-	-	(+)

注：肉毒梭菌的生化形狀并不規律，即使同型也常見(jiàn)到株間差異；+表示陽(yáng)性，-表示陰性，(±)表示視菌株而定，(+)表示多為陽(yáng)性反應，(-)表示多為陰性反應。

表三：各組肉毒梭菌的生化特性

組別	I組		II組			III組			IV組
芽孢位置	S	T		S	T		S	T		S	T
動(dòng)力	+	-		+			+	-		+
有氧環(huán)境	-			-			-			-
葡萄糖	+			+			+			-
乳糖	-			-			-			-
麥芽糖	-			+			d			-
甘露醇	-			-			-			-
卵?#23383;?#37238;	-			-			-	+		-
酯酶	+			+			+			-
七葉苷水解	+			-			-			-
肉渣消化	+			-			+	-		+	-
明膠液化	+			+			+			+
吲哚產(chǎn)生	-			-			-	+		-
牛乳反應	d			c	-		d			d
硝酸鹽還原	-			-			-			-
脲酶	-			-			-			-

注：S表示次端，T表示末端；+表示陽(yáng)性反應，-表示陰性反應，d表示能消化，c表示凝固。

肉毒梭菌的Ribotyping鑒定及分子分型

正?#39511;?#32905;毒梭菌的種內菌株的多樣性及其16S序列的高度保守性使得生化鑒定和16S測序鑒定等傳統技術(shù)對肉毒梭菌的鑒定存在諸多難點(diǎn)，所以研究者們不遺余力應用更多分子生物學(xué)技術(shù)以縮短肉毒梭菌的鑒定時(shí)間，簡(jiǎn)化鑒定流程，增加鑒定結果的準確性和重現性。

Ribotyping（核?#27714;w分型）是首個(gè)用于細菌鑒定和分型的分子指紋技術(shù)，無(wú)需依賴(lài)PCR技術(shù)，因此可避免非特異擴增問(wèn)題，具有較高的保真性。其是在RFLP（限制性片段長(cháng)度多態(tài)性）和Southern Blot印跡基礎上發(fā)展起來(lái)的一種鑒定和分型方法，它將細菌的全基因組DNA用限制性?xún)惹?#37238;消化，經(jīng)電泳分離和Southern Blot轉印后，用放射性標記的rRNA操縱子探針雜交，根據帶型和帶數的多態(tài)性對細菌進(jìn)行分子分型，同時(shí)因圖譜本身具備系統分類(lèi)學(xué)的意義，因此可將圖譜與標準菌株數據庫的指紋模式（Ribo Pattern）進(jìn)行比對，實(shí)現鑒定和分子分型的同步完成。

該方法的優(yōu)點(diǎn)之一是廣譜性、通用性和特異性兼顧。由于核?#27714;w編碼基因有較高的保守性，各種限制性酶切位點(diǎn)在細菌基因組內也廣泛分布，因此可用一種通用的探針和酶切方案對多種不同的微生物進(jìn)行檢測，實(shí)現廣譜分析，特別適合未知病原菌的篩查和溯源，也滿(mǎn)足大規模檢測及食物中毒應急檢測的需求。用戶(hù)也可為某一特定種屬的細菌進(jìn)行酶切方案和探針的探索及優(yōu)化，選用?#25105;?#37238;切或混和酶切的條件，及更為特異的探針，滿(mǎn)足更高特異性和分型力的需求，建立個(gè)性化的菌株指紋圖譜數據庫，見(jiàn)Grimont（1986）。

該方法的另一大優(yōu)點(diǎn)是分型力較好。由于核?#27714;w是細菌體內重要的蛋白質(zhì)合成“工廠(chǎng)”，細菌通常具有多個(gè)核?#27714;w編碼基因以滿(mǎn)足新陳代謝需要。通過(guò)Ribotyping，可獲得足夠數量不同分子大小的指紋條帶（一般為5~15條），具備較高的分型率和良好的重復性，分型圖譜穩定性高、條帶多，見(jiàn)Anne（1991）。

Schalch等（1997）曾采用Ribotyping技術(shù)對10個(gè)食物中毒暴發(fā)事件中收集而來(lái)的34株產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）進(jìn)行了分型，得到了12種指紋模式（Ribotype），且從原因食?#20998;?#21644;病人糞便樣本中分離得到的菌株的指紋模式高度吻合。

Hielm等（1999）首次采用Ribotyping技術(shù)對68株肉毒梭菌和5種相關(guān)的梭菌屬菌種進(jìn)行了鑒定和分型，以?#30142;?#35442;技術(shù)對引發(fā)中毒的肉毒梭菌的鑒定和分型能力。他們?#32676;?#35430;驗了13種限制性?xún)惹?#37238;，最終選擇以EcoR I和Hind III的酶切方案進(jìn)行鑒定和分型。這兩種酶切方案及Ribotyping技術(shù)均顯示出了良好的鑒定和分型效果，可以顯著(zhù)的區分蛋白分解型和非蛋白分解型的肉毒梭菌菌株，并被推薦為肉毒梭菌種屬鑒定的優(yōu)選方法。

他們隨后用GelCompar軟件對兩種酶切方案得到的指紋圖譜進(jìn)行了分型力分析以及UPGMA分析。結果顯示（見(jiàn)表四、圖二和圖三），EcoR I酶切獲得的Ribotyping指紋圖譜分型效果最好，分型指數（Discriminatory Index）高達0.982；Hind III酶切的分型能力也相當，分型指數為0.954。聚類(lèi)分析的結果顯示，各菌株間的Dice相似系數為35±13%（中值±標準差）。這些結果都表明Ribotyping技術(shù)非常適合用于肉毒梭菌的鑒定和分子分型。

Hielm等還認為，對于肉毒梭菌，Ribotyping的分型能力與PFGE（脈沖場(chǎng)凝膠電泳）相當，?#31227;?#22294;譜具備PFGE所缺乏的細菌分類(lèi)學(xué)意義，因此可用于肉毒梭菌的鑒定，而PFGE圖譜則因其隨機酶切的性質(zhì)，無(wú)法用于鑒定。另一方面，隨著(zhù)自動(dòng)化的Ribotyping技術(shù)（杜邦RiboPrinter? System）的問(wèn)世，大大簡(jiǎn)化了鑒定和分型流程，相比繁瑣和對操作技術(shù)要求較高的PFGE技術(shù)具有顯著(zhù)的優(yōu)勢。

表四：Ribotyping技術(shù)用于肉毒梭菌及其他梭菌屬菌株的分型能力分析

圖二：肉毒梭菌EcoR I酶切的Ribotyping指紋圖譜的聚類(lèi)分析

圖三：肉毒梭菌Hind III酶切的Ribotyping指紋圖譜的聚類(lèi)分析

自動(dòng)化的Ribotyping技術(shù)已經(jīng)在病原微生物的風(fēng)險分析和關(guān)鍵點(diǎn)控制（HACCP）體系、GMP體系、食品和藥品安全質(zhì)控和質(zhì)保、常規檢測、環(huán)境監測、法規制定和基礎研究等領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注并得到了長(cháng)足的應用。

隨著(zhù)美國杜邦公司的RiboPrinter®系統的問(wèn)世，Ribotyping技術(shù)實(shí)現了全自動(dòng)化和標準化（見(jiàn)圖四）。因其出眾的性能、簡(jiǎn)單的操作，RiboPrinter®系統已經(jīng)成為世界眾多微生物學(xué)、分子生物學(xué)實(shí)驗室開(kāi)展微生物鑒定和分子分型的首選設備，具備如下特點(diǎn)：

1.高通量，檢測速度快，鑒定加分子分型8小時(shí)內同步完成

2.結果準確，重復性和重現性好

3.廣譜的鑒定和分型能力，未知菌株可直接上機，無(wú)需預檢

4.通用試劑盒適用已知和未知細菌的鑒定和分型，及大規模篩查和應急檢測需求

5.開(kāi)放平臺可滿(mǎn)足更高特異性檢測和個(gè)性化研究需求

6.支持種屬特異試劑盒和多酶切方案滿(mǎn)足更高分型力需求或建立菌株數據庫

7.操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，標準化流程內設，結果自動(dòng)判讀，非經(jīng)驗豐富人員也只需簡(jiǎn)單培訓即可使用，節省不必要的用地和設備，人員8.培訓更簡(jiǎn)單，成本更低

9.標準數據庫容量為8528個(gè)基因模式，包括1741個(gè)種和297個(gè)屬，標準菌株均來(lái)源ATCC（美國模式培養物研究所）、JCM（日本微生物菌種保藏中心）和DSMZ（德國微生物菌種保藏中心）。涵蓋環(huán)境菌（如葡萄球菌、微球菌、芽孢桿菌、梭菌屬等）；致腐菌（芽孢桿菌、假單胞菌、明串珠菌、梭菌屬等）；致病菌（腸出血性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、弧菌、彎曲桿菌、阪崎腸桿菌等）；益生菌（乳酸桿菌、雙歧桿菌、乳球菌、嗜熱鏈球菌等）等多種類(lèi)型

圖四：杜邦RiboPrinter® System全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統及流程

Bruce等（1995 & 1996）和Webster等（1994）曾證明在沙門(mén)氏菌和單增李斯特氏菌菌株分型技術(shù)方面，RiboPrinter?系統比傳統技術(shù)更為?#34892;А?/div>

Wiedmann等（1996）曾成功用RiboPrinter®系統追溯到產(chǎn)品和環(huán)境中單增李斯特氏菌的污染，在動(dòng)物源性病原菌疾病暴發(fā)的控?#21697;?#38754;起到了積極作用。無(wú)獨有偶，Bruce等（1996）也成功用RiboPrinter®系統追溯到了食品加工廠(chǎng)環(huán)境中的金黃色葡萄球菌污染。

在Hielm等人的研究基礎上，Skinner等（2000）采用RiboPrinter®系統對30株肉毒梭菌和1株生孢梭菌的鑒定和分型能力進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，獲得了成功。

他們開(kāi)展該工作的原因之一，是?#39511;镠ielm等（1998）曾報道，采用PFGE對非蛋白分解型肉毒梭菌進(jìn)行分型比較困難，很難獲得高質(zhì)量的指紋圖譜。而且在分析B、E、F三型非蛋白分解型肉毒梭菌時(shí)，菌株DNA的?#21040;?#25104;了一個(gè)非常困擾的問(wèn)題。而此前，Samore等（1996）已經(jīng)報道了，在33株難辨梭菌（Clostridium difficile）的分型工作中，PFGE對其中的23株都沒(méi)有成功分型，推測的原因也是菌株DNA的意外?#21040;狻?/div>

這31株各型的肉毒梭菌（見(jiàn)表五）均來(lái)自于美國食品藥品監督管理局和罐頭食品企業(yè)，被接種于改良的厭氧卵黃瓊脂培養基上，在35℃下培養24h。用3mL緩沖液（2 mM Tris + 20 mM EDTA）淋洗平板及用滅菌接種針刮擦平板表面以獲得營(yíng)養細胞，制成30µL每管的細胞混懸液，直接用于RiboPrinter®系統分析，經(jīng)系統自動(dòng)的加熱滅活、裂解、標準EcoR I酶切及后續分析等流程，獲得了較為理想的結果。

表五：Skinner等用于分析的肉毒梭菌菌株表

31株菌的分型結果如表六和圖五所示。Skinner等定義菌株相似度>93%的圖譜被歸為一個(gè)Ribogroup，故31株菌可被分成15個(gè)Ribogroup，并顯示了較高的重現性。其中23株蛋白分解型菌株（含A型和B型），5株非蛋白分解型菌株（B型）和2株E型菌株及1株生孢梭菌均得到了高分辨的分型。

表六：31株肉毒梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株經(jīng)EcoR I酶切的Ribogroups模式列表

圖五：30株肉毒梭菌經(jīng)EcoR I酶切獲得15組Ribogroup圖譜

Skinner?#20837;S即對菌株的來(lái)源和菌株的分組進(jìn)行?#21496;C合分析，證實(shí)了RiboPrinter®系統在菌株溯源方面的應用價(jià)值，見(jiàn)表七。

表七：部分肉毒梭菌菌株的追溯和圖譜分析

Ribogroup	菌株	來(lái)源與圖譜分析
128-1	CAM3-A, CAM5-B	來(lái)源于同一個(gè)雞肉蔬菜湯罐頭加工廠(chǎng)，來(lái)自于同一個(gè)生產(chǎn)批次的兩個(gè)罐頭樣本，分型結果在同一個(gè)Ribogroup
137-3	OS3-A, 4896-A	均從1983年美國伊利諾伊州肉毒梭菌食物中毒事件中收集而來(lái)，其中4896-A來(lái)自病人的糞便，OS3-A來(lái)自于最終確認的原因食品——炒洋蔥，這兩株菌不僅被分在了一個(gè)Ribogroup中，?#25233;?#32011;圖譜相似度高達99%
121-7	Mush2-B, Mush3-B	均來(lái)自于1975年同一批次生產(chǎn)的鮮蘑菇，分型結果在同一個(gè)Ribogroup
121-7	383-B, 642-B	來(lái)源于1972-1973年生產(chǎn)的兩個(gè)批次鮮蘑菇樣本，分型結果在同一個(gè)Ribogroup
137-8	C. sporogenes PA 3679	該生孢梭菌的圖譜與A型肉毒梭菌的相似，從細菌分類(lèi)學(xué)上很容易得到解?#23560;(zhuān)驗?#20854;與組I肉毒梭菌具有相似的培養和生化特征，唯一的區別是不會(huì )產(chǎn)BoNTs

從表七中可以看出，來(lái)源相近的肉毒梭菌菌株最終被追溯到同一個(gè)Ribogroup組別（如128-1, 137-3, 121-7,），而生化性質(zhì)與肉毒梭菌接近的生孢梭菌則被分為了一個(gè)新的Ribogroup組別（如137-8），體現了RiboPrinter®系統較好的菌株追溯能力，及干擾菌株的排他能力，這在食物中毒病原體追溯、原因食品追溯、流行病學(xué)調查、院內感染、生產(chǎn)環(huán)境監測和污染源追溯等領(lǐng)域有十分重要的應用價(jià)值。

圖六：29株肉毒梭菌經(jīng)EcoR I酶切獲得的9組Ribogroup圖譜

Kennett等（2006）也采用RiboPrinter®系統及EcoR I酶切方案，對梭菌屬的7種，共計49株可引發(fā)食源性疾病的梭菌菌株進(jìn)行了鑒定和分型，包括：耐氧梭菌（Clostridium aerotolerans），拜氏梭菌（Clostridium beirjerinckii），腐敗梭菌（Clostridium putrificum），肉毒梭菌，酪酸梭菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌和生孢梭菌。Kennett等同時(shí)設計了EcoR V酶切方案消化17株肉毒梭菌，以?#30142;?#19981;同酶切方案對鑒定和分型效果的改善作用。結果證實(shí)RiboPrinter®系統可以較好地鑒定和分型這些梭菌屬的菌株，還可通過(guò)調整限制性酶切方案來(lái)分型不同表型和產(chǎn)毒型的菌株，可選的限制性?xún)惹?#37238;除了EcoR I和EcoR V之外，還可選Cla I，Hind III，Spe I，Rsa I等，部分圖譜可見(jiàn)圖六。

綜上所述，杜邦RiboPrinter® System在肉毒梭菌及其他梭菌屬細菌的鑒定和分子分型領(lǐng)域有著(zhù)廣闊的應用前景和突出的使用價(jià)值。依托杜邦的行業(yè)領(lǐng)先技術(shù)，該鑒定分型產(chǎn)品的技術(shù)路線(xiàn)可?#34892;?#22320;保障政府檢測機構、第三方檢測實(shí)驗室、研究?#26680;?#21644;食品、藥品企業(yè)快速、準確、標準化地鑒定和分型肉毒梭菌，建立菌株信息庫，?#34892;?#36861;溯污染菌株，從而預警和控制潛在的肉毒梭菌暴發(fā)和致命食源性疾病發(fā)生的風(fēng)險。

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編輯：songjiajie2010

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