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一¡¢摘要
由于嬰兒配方奶粉生產(ch¨£n)商需要檢測每批原料和成品是否存在三聚氰胺和三聚氰酸£¬因此有必要提供一種快速分析方法¡£本文所述的基于A(y¨ªng)CQUITY UPLC/MS/MS的方法由一家大型嬰兒配方奶粉生產(ch¨£n)商的實(sh¨ª)驗室開(k¨¡i)發(f¨¡)£»經(j¨©ng)證實(sh¨ª)£¬該方法非常靈敏且極其耐用£¬每天能分析100多個(g¨¨)樣本¡£
二¡¢引言
近期牛奶和乳制品中含三聚氰胺事件已經(j¨©ng)導致中國數以千計的兒童患病£¬有部分患兒死亡¡£三聚氰胺£¨1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺£»CAS# 108-78-1£©常用于塑料¡¢粘合劑¡¢涂料和阻燃劑的生產(ch¨£n)¡£三聚氰酸£¨1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮£»CAS# 108-80-5£©是三聚氰胺的一種結構類(l¨¨i)似物£¬多作為三聚氰胺的雜質(zh¨¬)而被發(f¨¡)現¡£這些化合物的化學(xu¨¦)結構如圖1所示¡£
三聚氰胺因其高含氮量而在中國某些地區被用以提高牛奶的表觀(gu¨¡n)蛋白含量¡£人們認為£¬這兩種化合物相結合可引起腎毒性¡£迄今為止£¬很多監管機構已經(j¨©ng)提議將其在嬰兒配方奶粉和成人食品中的限量分別定為1.0 ppm£¨μg/g£©和2.5 ppm£¨μg/g£©¡£美國FDA最近提議1.0 ppm可作為嬰兒配方奶粉成品中三聚氰胺或三聚氰酸的容許量£¬但規定這兩種化合物不能同時(sh¨ª)存在¡£其他監管機構£¨如臺?#24120;?#23559;三聚氰胺的限量降低至0.05 ppm¡£用于檢測面粉1和寵物食品2中的三聚氰胺和三聚氰酸的方法已經(j¨©ng)進(j¨¬n)行過(gu¨°)介紹£¬Shia和Diehl描述了使用特殊的SPE對嬰兒配方奶粉3中三聚氰胺和三聚氰酸進(j¨¬n)行萃取¡£然而£¬為確保嬰兒配方奶粉的安全性并盡可能及時(sh¨ª)滿(m¨£n)足監管機構的檢測要求£¬我們開(k¨¡i)發(f¨¡)了一種用于同步測定三聚氰胺£¨MEL£©和三聚氰酸£¨CYA£©的高靈敏¡¢更快速的新型檢測方法£¬以實(sh¨ª)現高通量的產(ch¨£n)品篩查¡£該方法也適用于分析原料£¨如酪蛋白或乳清蛋白分離物£©£¬從而在用于嬰兒配方奶粉生產(ch¨£n)前先對其進(j¨¬n)行核實(sh¨ª)¡£同位素內標用于校正樣品制備過(gu¨°)程中出現的微小偏差£¬并校正儀器對目標化合物響應中存在的基質(zh¨¬)效應¡£
三¡¢試驗
三聚氰胺和三聚氰酸的儲備液分別溶解于100mL水中而配制出濃度為100μg/mL的溶液¡£混合標準溶?#21644;?#36942;(gu¨°)用流動(d¨°ng)相B將三聚氰胺和三聚氰酸儲備液分別稀釋為 2.5μg/mL和5.0μg/mL而制得¡£混合標準溶液每天現用現配¡£
三聚氰胺£¨13C3-15N3-三聚氰胺£©和三聚氰酸£¨13C3-15N3-三聚氰酸£©的同位素內標以0.1mg/mL水溶液的形式從劍橋同位素實(sh¨ª)驗室購得¡£分析當天£¬穩定的同位素混合標準溶?#21644;?#36942;(gu¨°)將同位素內標溶液¡¢標準溶液及2%的甲酸乙腈溶液按1:1:2的比例進(j¨¬n)行混合而制得¡£
四¡¢制備程序
¡ö 對于原料£¬稱(ch¨¥ng)量1.0g樣品放入一個(g¨¨)20mL的玻璃瓶中
¡ö 添加10.0g水并混勻£¬使樣品溶解-將溶解后的樣品用作營(y¨ªng)養品樣品
¡ö 稱(ch¨¥ng)取1.0g產(ch¨£n)品£¨粉末或液體£©或制備好的原料放入一個(g¨¨)20mL的玻璃瓶中¡£
¡ö 加入等量的混合內標溶液
¡ö 加入5mL的甲酸水溶?#28023;?#39636;積比2%£©
¡ö 通過(gu¨°)渦旋混合15秒左?#19968;?#28151;合至所有固體均已溶解為止
¡ö 在第二個(g¨¨)20mL的玻璃瓶中放入9mL含10mM醋酸銨的體積比為97/3的乙腈/水溶液
¡ö 將1 mL制備好的樣品溶液轉移至上述第二個(g¨¨)玻璃瓶¡£
¡ö 混勻
¡ö 通過(gu¨°)一個(g¨¨)0.2μm的PTFE濾膜過(gu¨°)濾樣品并將濾液收集到進(j¨¬n)樣瓶中
六¡¢UPLC條件
?#21512;?#33394;譜?#21040;y£º 沃特世ACQUITY UPLC®
色譜柱£º ACQUITY UPLC BEH HILIC 2.1 x 150£¬1.7μm
流動(d¨°ng)相£º A£º10 mM醋酸銨水溶液 B£º溶于97/3乙腈£¯水的10 mM醋酸銨
弱洗針?#28023;?甲醇
強洗針?#28023;?水
進(j¨¬n)樣針類(l¨¨i)型£º PEEK
定量環(hu¨¢n)£º 10μL
進(j¨¬n)樣類(l¨¨i)型£º 滿(m¨£n)環(hu¨¢n)進(j¨¬n)樣
七¡¢質(zh¨¬)譜條件
質(zh¨¬)譜?#21040;y£º 沃特世ACQUITY? TQD
軟件£º 沃特世MassLynxTM 4.1
三聚氰胺
離子化模式£º ESI+
毛細管電?#28023;?3.50 kV
三聚氰酸
離子化模式£º ESI-
毛細管電?#28023;?3.00 kV
源溫度£º 150¡æ
脫溶劑氣溫度£º 400¡æ
錐孔氣流速£º 50 L/小時(sh¨ª)
脫溶劑氣流速£º 900 L/小時(sh¨ª)
碰撞氣流速£º 0.15 mL£¯分鐘
包括同位素內標在內£¬每個(g¨¨)化合物有2個(g¨¨)離子通道¡£第二個(g¨¨)通道用于確認£¬峰面積的比例必須與實(sh¨ª)際標準品的相匹配才能被認定結果呈陽(y¨¢ng)性¡£
八¡¢結果和討論
三聚氰胺和三聚氰酸的校準曲線(xi¨¤n)通過(gu¨°)目標化合物和同位素內標的響應比相對于目標化合物濃度而生成¡£三聚氰胺£¨0.25 - 40.0ng/mL£©和三聚氰酸£¨0.50 -80.0ng/mL£©的校準曲線(xi¨¤n)均?#31034;€(xi¨¤n)性£¬儀器得到的相關(gu¨¡n)系數£¨R2£©均大于0.99¡£三聚氰胺和三聚氰酸的校準殘差均低于10%¡£典型的校準曲線(xi¨¤n)和殘差圖如圖2所示
該方法的精準性是通過(gu¨°)在方法定量限濃度上對代表性樣品和配料加標進(j¨¬n)行評估¡£成品加標量為0.083μg/g三聚氰胺和0.568μg/g三聚氰酸¡£原料加標量為0.416μg/g三聚氰胺和1.26μg/g三聚氰酸¡£三聚氰胺和三聚氰酸的回收?#31034;?#20171;于90 - 110%之間£¬?#22902;?#20839;由多位分析員用兩臺儀器得出的八次獨立測定結果的相對標準偏差的平均值幾乎都< 10%¡£結果匯總于表1¡£
方法檢出限£¨MDL£©和方法定量限£¨MQL£©根據40CFR第136部分附錄B所述的方法進(j¨¬n)行確定¡£檢出限根據所測定濃度的標準差計算得出£¬定量限被定義為檢出限的三倍¡£在8天內用兩臺儀器分別對加標樣品進(j¨¬n)行分析后£¬三聚氰胺和三聚氰酸的方法定量限分別被確定為0.039μg/g和0.105μg/g¡£由于原料分析需要進(j¨¬n)行稀?#23560;(zhu¨¡n)?#22240;此檢出限大約高出10倍¡£
串聯(li¨¢n)質(zh¨¬)譜可在選擇反應監測£¨或多反應監測£©模式下進(j¨¬n)行選擇性檢測¡£在這種運行模式下£¬僅可檢出特定母離子/子離子對的化合物¡£如圖3所示£¬三聚氰胺的產(ch¨£n)物離子光譜包含兩個(g¨¨)子離子¡£
在三聚氰胺分析中同時(sh¨ª)監測兩個(g¨¨)MS/MS通道而使得方法專(zhu¨¡n)一性增強¡£如果在127→85和127→68 MRM色譜圖中存在相同色譜峰£¬并且該峰的響應比必須在所得到的標準品響應比的20%以?x¨²n)龋¬Ä敲?#21487;以鑒定出三聚氰胺陽(y¨¢ng)性的結果¡£標準品£¨0.25ng/mL三聚氰胺和2.0ng/mL三聚氰酸£©¡¢一種非強化型嬰兒配方奶粉和一種強化型嬰兒配方奶粉£¨0.083μg/g三聚氰胺和0.568μg/g三聚氰酸£©的典型色譜圖如圖4所示¡£
使用同位素內標可大大增強該方法的定量能力和耐用性¡£通過(gu¨°)這種簡(ji¨£n)單稀釋和進(j¨¬n)樣程序£¬每天僅使用ACQUITY TQD即可對100多份樣品是否存在三聚氰胺和三聚氰酸進(j¨¬n)行檢測¡£經(j¨©ng)證實(sh¨ª)£¬該方法適合分析95%以上的嬰兒配方奶粉¡¢營(y¨ªng)養品和蛋白粉樣品¡£在其他情況下£¬或者對有共流出干擾的復雜基質(zh¨¬)£¬應采用一個(g¨¨)包括陽(y¨¢ng)離子或陰離子交換SPE的固相萃取£¨SPE£©步驟¡£
九¡¢結論
現已開(k¨¡i)發(f¨¡)出一種用于同時(sh¨ª)測定液體和粉末狀嬰兒配方奶以及成人營(y¨ªng)養品中三聚氰胺和三聚氰酸的快速而耐用的方法£¬并根據40 CFR第136部分進(j¨¬n)行了驗證¡£成品中三聚氰胺的檢出限和定量限分別為0.013μg/g和0.039μg/g£¬三聚氰酸相應為0.035μg/g和0.105μg/g¡£對于加標樣品£¨n=48¡¢8天¡¢兩臺儀器£©而言£¬三聚氰胺£¨0.083μg/g£©的平均回收率和精確度為100.9%£¬相對標準差6.8%£»三聚氰酸£¨0.568μg/g£©為99.1%£¬相對標準差10.4%¡£
簡(ji¨£n)單稀釋后£¬配備TQ檢測器的ACQUITY UPLC?#21040;y可同時(sh¨ª)對三聚氰胺和三聚氰酸進(j¨¬n)行快速分析£¨不到6分鐘£©¡£UPLC?與串聯(li¨¢n)質(zh¨¬)譜檢測相結合提供了卓越的靈敏度和每天分析超過(gu¨°)100份樣品的高通量¡£同位素內標的加入在較寬的濃度范圍內和各種產(ch¨£n)品類(l¨¨i)型中提供了良好的線(xi¨¤n)性和定量效果£¬從而使三聚氰胺和三聚氰酸的鑒定和定量結果可信¡£
所述方法具有快速篩查包括嬰兒配方奶粉的蛋白原料¡¢奶源和營(y¨ªng)養品的能力£¬從而可確保生產(ch¨£n)商和監管機構能保證產(ch¨£n)品的安全性和完整性¡£
