用固體培養基分離嚴格厭氧菌有特殊性，如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后置放在封閉的容器中培養，容器中的氧氣可采用化學(xué)、物理或生物的方法清除。對于那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養的分離則可采用稀釋搖管培養法進(jìn)行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式。先將一系列盛無(wú)菌瓊脂培養基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進(jìn)行梯度稀?#23560;(zhuān)?#35430;管?#26438;?#25622;動(dòng)均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養基和空氣隔開(kāi)。培養后，菌落形成在瓊脂柱的中間。進(jìn)行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一只毛細管插入瓊脂和管壁之間，吹入無(wú)菌無(wú)氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養皿中，用無(wú)菌刀將瓊脂柱切成薄片進(jìn)行觀(guān)察和菌落的移植。

 

 

大多數細菌和真菌，用平板法分離通常是滿(mǎn)意的，?#39511;?#23427;們的大多數種類(lèi)在固體培養基上長(cháng)得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養基上生長(cháng)，例如一些細胞大的細菌、許多原生動(dòng)物和藻類(lèi)等，這些微生物仍需要用液體培養基分離來(lái)獲得純培養。

稀釋法?#19988;?#39636;培養基分離純化常用的方法。接種物在液體培養基中進(jìn)行順序稀?#23560;(zhuān)?#20197;得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個(gè)微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數試管中沒(méi)有微生物生長(cháng)，那么有微生物生長(cháng)的試管得到的培養物可能就是純培養物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長(cháng)的比例提高了，得到純培養物的機?#31034;?#26371;(huì )急劇下降。因此，采用稀釋法進(jìn)行液體分離，必須在同一個(gè)稀釋度的許多平行試管中，大多數（一般應超過(guò)95%）表現為不生長(cháng)。

 

 

只能分離出混雜微生物群體中占數量?jì)?yōu)勢的種類(lèi)是稀釋法的一個(gè)重要缺點(diǎn)。在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數。這時(shí)，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養以獲得純培養，稱(chēng)為單細胞（或單孢子）分離法。單細胞分離法的難度與細胞或個(gè)體的大小成反比，較大的微生物如藻類(lèi)、原生動(dòng)物較容易，個(gè)體很小的細菌則較難。

較大的微生物，可采用毛細管提取單個(gè)個(gè)體，并在大量的滅菌培養基中轉移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進(jìn)行。對于個(gè)體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細胞或孢子以獲得純培養。在沒(méi)有顯微操作儀時(shí)，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進(jìn)行單細胞分離，例如將經(jīng)適當稀釋后的樣?#20998;?#20633;成小液滴在顯微鏡下觀(guān)察，選取只含一個(gè)細胞的液體來(lái)進(jìn)行純培養物的分離。單細胞分離法對操作技術(shù)有?#23481;^高的要求，多限于高度專(zhuān)業(yè)化的科學(xué)研究中采用。

 

 

沒(méi)有一種培養基或一種培養條件能夠滿(mǎn)足一切微生物生長(cháng)的需要，在一定程度上所有的培養基都是選擇性的。如果某種微生物的生長(cháng)需要?#19988;?#30693;的，也可以設計特定環(huán)境使之適合這種微生物的生長(cháng)，因而能夠從混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養出來(lái)，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數。這種通過(guò)選擇培養進(jìn)行微生物純培養分離的技術(shù)稱(chēng)為選擇培養分離，特別適用于從自然界中分離、尋找有用的微生物。自然界中，在大多數場(chǎng)合微生物群落是由多種微生物組成的，從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當某一種微生物所存在的數量與其它微生物相比非常少時(shí)，單采用一般的平板稀釋法幾乎是不可能的。要分離這種微生物，必須根據該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養、生理、生長(cháng)條件等，采用選擇培養分離的方法。或抑制使大多數微生物不能生長(cháng)，或造成有利于該菌生長(cháng)的環(huán)?#24120;?#32147;(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養后使該菌在群落中的數量上升，再通過(guò)平板稀釋等方法對它進(jìn)行純培養分離。

根據待分離微生物的特點(diǎn)選擇不同的培養條件，有多種方法可以采用。例如要分離高溫菌，可在高溫條件下進(jìn)行培養；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進(jìn)行分離；有些微生物如螺旋體、粘細菌、藍細菌等能在瓊脂平板表面或里面滑行，可以利用它們的滑動(dòng)特點(diǎn)進(jìn)行分離純化，?#39511;?#28369;行能使它們自己和其它不能移動(dòng)的微生物分開(kāi)。可將微生物群落點(diǎn)種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反復進(jìn)行，得到純培養物。

富集培養法原理和方法非常簡(jiǎn)單，利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應于該條件的微生物旺盛生長(cháng)，從而使其在群落中的數量大大增加，很容易地分離到所需的特定微生物。富集條件可根據所需分離的微生物的特點(diǎn)從物理、化學(xué)、生物、及綜合多個(gè)方面進(jìn)行選擇，如溫度、pH、紫外線(xiàn)、高壓、光照、氧氣、營(yíng)養等等許多方面。在相同的培養基和培養條件下，經(jīng)過(guò)多次重復移種，最后富集的菌株很容易在固體培養基上長(cháng)出單菌落。如果要分離一些專(zhuān)性寄生菌，就必須把樣?#26041;?#31278;到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長(cháng)。通過(guò)多次重復移種便可以得到純的寄生菌。

 

 

分離的目的通常是要得到純培養。然而，在有些情況下這是很難做到的。但可用二元培養物作為純化培養的替代物。含有二種以上微生物的培養物稱(chēng)為混合培養物，而如果培養物中只含有二種微生物，而且是有意識的保持二者之間的特定關(guān)系的培養物稱(chēng)為二元培養物。例如二元培養物是保存病毒的最有效途徑，?#39511;?#30149;毒是細胞生物的嚴格的細胞內寄生物。有一些具有細胞的微生物也是嚴格的其它生物的細胞內寄生物，或特殊的共生關(guān)系。對于這些生物，二元培養物是在實(shí)驗室控制條件下可能達到的最接近于純培養的培養方法。另外，獵食細小微生物的原生動(dòng)物也很容易用二元培養法在實(shí)驗室培養，培養物由原生動(dòng)物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲(chóng)、變形蟲(chóng)和粘菌。